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細胞、組織及菌類(lèi)等需勻漿處理的樣本的處理

1. 細胞樣本

   懸浮細胞:

   4℃,1000-2000×g離心10 min收集細胞,按照106個(gè)細胞加入300-500 μL勻漿介質(zhì)的比例加入勻漿介質(zhì),進(jìn)行機械勻漿,充分破碎(無(wú)明顯的細胞沉淀,可在顯微鏡下觀(guān)察),4℃,10000×g離心10 min,取上清置于冰上待測,若不能當天檢測,于-80℃保存,可保存一個(gè)月。

   貼壁細胞:

   吸棄培養液,用PBS(0.01 M,pH 7.4)將細胞洗一遍。用細胞刮刮下細胞(不能用胰酶和EDTA處理),加入2-5 mL PBS(0.01 M,pH 7.4),收集細胞懸液,后處理方法見(jiàn)懸液細胞處理方法。

2. 10%組織勻漿

   取0.020-1.0 g新鮮組織塊,用2-8℃的PBS(0.01 M,pH 7.4)漂洗,去除血液,濾紙吸干,稱(chēng)重,放入勻漿容器中,按照重量(g):體積(mL)=1:9的比例加入2-8℃的勻漿介質(zhì),進(jìn)行勻漿,4℃,10000×g離心10 min,取上清置于冰上待測,若不能當天檢測,于-80℃保存,可保存一個(gè)月。

3. 線(xiàn)粒體樣本

   將10%組織勻漿,4℃,1500×g離心10 min,將上清液4℃,10000×g離心15 min,棄去上清,沉淀即為線(xiàn)粒體。加入勻漿介質(zhì)溶解后待測。

4. 脂肪組織

   取新鮮組織塊(20 mg-1.0g),按照重量(g):體積(mL)=1:9的比例加入2-8℃的勻漿介質(zhì),進(jìn)行勻漿,4℃,1500×g離心10 min,用棉簽吸取上層乳白色液體,吸取中層澄清液體待測。

5. 微生物樣本

   將菌液于4℃、1000-2000×g離心10 min收集xi菌,用PBS(0.01 M,pH 7.4)將菌沉淀洗2-3遍,然后按照原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液(一般為50 mM Tris-HCl,pH 8.0,2mM EDTA,100 mM NaCl,加溶菌酶至100 ug/ml,0.1% Triton X-100,具體情況根據所測指標選擇)重懸菌體,在冰水浴條件下,超聲破碎(條件一般是300w,超聲10s間隔10s,總時(shí)間10分鐘,具體條件可根據自身情況而定)。

如何判斷是否超聲完全:

 ① 外觀(guān)判斷:超聲前菌懸液是渾濁的,超聲完全后變的透明、清澈。

 ② 液體的粘滯性:超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

 ③ 高速離心:有用高速離心檢測超聲破碎程度的(一般用6000×g離心10 min,比一般離心收集菌體的轉速高一點(diǎn))。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌體。

一些需要注意的問(wèn)題:

 ① 如果超聲時(shí)出現黑色沉淀,說(shuō)明超聲功率太強。

 ② 超聲時(shí)間太長(cháng)、功率太高對蛋白活性肯定有影響。

 ③ 盡量防止泡沫的產(chǎn)生。

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