實(shí)時(shí)熒光定量PCR 即 Real time PCR(也稱(chēng)實(shí)時(shí)定量PCR)定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實(shí)時(shí)定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數擴增期間通過(guò)連續監測熒光信號強弱的變化來(lái)即時(shí)測定特異性產(chǎn)物的量，并據此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的主要應用：
1. DNA 或RNA 的定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動(dòng)植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等
2. 基因表達差異分析：例如比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如處理、物理處理、化學(xué)處理等 )，特定基因在不同時(shí)相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結果的確證
3. 基因分型：例如SNP 檢測，甲基化檢測等
Realtime PCR 常用的兩種方法分別為：Sybr green（熒光染料摻入法） 和Taqman probe （探針?lè )ǎ?/span>
SYBR green
在PCR反應體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì )發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
此方法適用：
1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上
2、通用性好,不需要設計探針,方法簡(jiǎn)便,省時(shí),價(jià)格低廉。
3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用。
4、高通量大規模的定量PCR檢測
5、專(zhuān)一性要求不高的定量PCR檢測。
Taqman Probe
PCR擴增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步
此方法適用：
1、具有高適應性和可靠性，實(shí)驗結果穩定重復性好，特異性更高。
2、適用于擴增序列專(zhuān)一的體系的檢測。
3、樣品中靶基因含量過(guò)低的定量PCR檢測。
4、靶基因的特異序列較短，無(wú)論怎樣優(yōu)化引物設計條件都不能解決。
5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。
6、廣泛用于人類(lèi)傳染病的診斷和病原定量,在動(dòng)物病原體基因的檢測,畜禽產(chǎn)品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。