實(shí)時(shí)熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR，即二代PCR，是指在PCR擴增反應體系中加入熒光染料或者熒光基團，在整個(gè)PCR過(guò)程中通過(guò)收集熒光信號實(shí)時(shí)監測每一個(gè)循環(huán)中擴增產(chǎn)物量的變化，zui后通過(guò)標準曲線(xiàn)和CT值對待測樣品進(jìn)行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針?lè )ā?/span>
熒光染料法（SYBR Green）：
SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中zui常用的熒光染料，它能與所有的雙鏈DNA結合。在PCR反應體系中，加入SYBR Green Ⅰ，它就會(huì )在過(guò)程中與雙鏈DNA結合，從而產(chǎn)生熒光信號。因此，反應中發(fā)出的全部熒光信號就會(huì )與反應中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強度也會(huì )隨著(zhù)產(chǎn)物的增加而增加。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結合，因此可能產(chǎn)生假陽(yáng)性的結果。
優(yōu)點(diǎn)：價(jià)格相對較低；使用方便；對DNA模板沒(méi)有選擇，通用性好；檢測靈敏度高。
缺點(diǎn)：可能產(chǎn)生假陽(yáng)性結果，需要通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析識別擴增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應體系以降低非特異性擴增；不適合進(jìn)行多重qPCR檢測。
熒光探針?lè )ǎ═aqMan技術(shù)）：
TaqMan探針是zui早用于定量的方法，也是臨床檢測中zui常用的檢測方法。PCR擴增時(shí)，加入一對引物的同時(shí)再加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針是一個(gè)寡核苷酸，5'端標記一個(gè)熒光報告基團（Reporter, R），3'端標記一個(gè)淬滅基團（Quencher, Q）。當探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收，以至于無(wú)法檢測到熒光信號；而當PCR擴增時(shí)（在延伸階段），探針會(huì )被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解，使報告基團和淬滅基團分離，報告基團發(fā)射底的熒光不會(huì )再被吸收，從而可以在熒光監測系統接收到熒光信號，即每擴增一條DNA，就形成一個(gè)熒光分子，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成完全同步，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號累積的越多，熒光強度越大。
優(yōu)點(diǎn)：檢測特異性強；靈敏度高；適合進(jìn)行多重qPCR檢測；PCR后續無(wú)需處理，節省時(shí)間和原料成本。
缺點(diǎn)：需要根據不同的序列，合成不同的探針；探針的水解依賴(lài)Taq酶外切酶的活性，定量時(shí)容易受試劑和酶性能影響；淬滅難以徹底，本底較高；檢測結果很難判斷實(shí)際的擴增特性。