免 疫熒光(immunofluorescence，IF)根據抗原抗體反應，將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標記在抗體上，與其相應的抗原反應后，在熒光顯微鏡下針對熒光標記分子的激發(fā)光發(fā)射光進(jìn)行觀(guān)察，從而檢測目的指標的相對含量、在組織細胞中的定位。
操作步驟：
1、細胞準備：對單層生長(cháng)細胞，在傳代培養時(shí)，將細胞接種到預先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長(cháng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長(cháng)細胞，取對數生長(cháng)細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
2、固定：根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.
3、通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
4、封閉：使用封閉液對細胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.
5、一抗結合：室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
6、二抗結合：間接免 疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
7、封片及檢測：滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。