引物的另一個(gè)重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。根據GC含量估算Tm。確定引物Tm zui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列1級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會(huì )差異很大。因為大部分公式提供一個(gè)估算的Tm值，所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)?？梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開(kāi)始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì )減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。為獲得zui佳結果，兩個(gè)引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過(guò)5℃，就會(huì )引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設定為比zui低的Tm低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在根據較低Tm設計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。