PCR引物設計原則細節盤(pán)點(diǎn):
1、.引物長(cháng)度:一般為15～30 bp ，引物太短會(huì )影響PCR的特異性，引物太長(cháng)PCR的zui 適延伸溫度會(huì )超過(guò)Taq酶的zui適溫度，也影響反應的特異性。
2、.堿基分布：四種堿基ui好應隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續出現3個(gè)以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴增的復性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。
3、3‘端要求：3’端必須與模板嚴格互補，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級結構的可能。末位堿基是A時(shí)錯配的引發(fā)效率zui低，G、C居中間，因此引物的3’端zui好選用A、G、C而盡可能避免連續出現兩個(gè)以上的T。
4、引物自身二級結構：引物自身不應存在互補序列，否則會(huì )自身折疊成發(fā)夾狀結構或引物自身復性。
5、引物之間的二級結構：兩引物之間不應有多于4個(gè)連續堿基互補，3’端不應超過(guò)2個(gè)。
6、同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應小于連續8個(gè)的互補堿基存在。
g.5’端無(wú)嚴格限制：5’末端堿基可以游離，但zui好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結合穩定。還可以進(jìn)行特異修飾（標記、酶切位點(diǎn)等）等等。
根據實(shí)驗目的選擇適當的引物。常用引物設計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設置。