在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加酶結合物和顯色劑后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)，有人稱(chēng)之為孵育。
溫育的時(shí)間選擇：
溫育這一步是ELISA測定中容易出現問(wèn)題的步驟。目前國內ELISA試劑盒的反應溫育時(shí)間為37℃ 30分鐘-1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1-2小時(shí)才能有較完全的結合，低于1小時(shí)，可能會(huì )影響測定下限。
ELISA屬固相免 疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會(huì )，只有貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點(diǎn)。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時(shí)間的溫育。
溫育所需時(shí)間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時(shí)間相對較短。
溫育的溫度選擇：
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。
在建立ELISA方法作反應動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的**可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為徹底，在放射免 疫測定中多使反應在冰箱中過(guò)夜，以形成多的沉淀。但因所需時(shí)間太長(cháng)，在ELISA中一般不予采用。