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聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)標準過(guò)程

PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈式反應,是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。

標準的PCR過(guò)程分為三步:

第1步,DNA變性(90℃-96℃)雙鏈DNA在高溫作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA。

模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應做準備;

第2步,退火(60℃-65℃)溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

第3步,延伸(70℃-75℃)在Taq酶的作用下,以dNTP為原料,從引物的3′端開(kāi)始以從5′到3′端的方向延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

DNA模板--引物結合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,就可獲得更多的“半保留復制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘, 2~3小時(shí)就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬(wàn)倍。

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