1.包被抗體：用碳酸鹽緩沖液（CBS）或者磷酸鹽緩沖液（PBS）根據實(shí)驗需要，將包被抗體稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔包被， 37℃、2h或者4℃過(guò)夜。
2.洗板：棄孔內液體，甩干，10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)洗板2次，每次浸泡1-2min， 350μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內液體拍干）。
3.封閉：含1% BSA或者5%脫脂牛奶的10mM PBST(10mM PBS 0.05% Tween-20)做封閉液，350-400μl/孔，37℃、2h。
4.洗板：同步驟2。（備注：商品化試劑盒一般已經(jīng)預包被了包被抗體在酶標板上，不需要進(jìn)行1-4步驟，使用前請注意核實(shí)）。
5.加樣：分別設零孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl。（注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，一塊板要在10 min內上完樣品。）酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應60-120min。為保證實(shí)驗結果有效性，每次實(shí)驗請使用新的標準品溶液。
6.洗板：棄孔內液體，甩干，10mM PBST（10mM PBS 0.05% Tween-20）洗板4次，每次浸泡1-2min，350-400μl/孔，甩干（也可以輕拍將孔內液體拍干）。
7.加檢測抗體：根據實(shí)驗需要，將檢測抗體用PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。
8.洗板：同步驟6。
9.加二抗：根據實(shí)驗需要，將二抗用10mM PBST稀釋到一定的稀釋度，100μl/孔，37℃、1h。
10.洗板：同步驟6。
11.酶標儀讀值：以630nm為校正波長(cháng)，用酶標儀在450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD值），在加終止液后5min內進(jìn)行讀數。
12.結果判斷：
a.每個(gè)標準品和樣本的OD值須減去零孔的OD值，如設置復孔，則應取其平均值；
b.以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，使用專(zhuān)業(yè)制作曲線(xiàn)軟件進(jìn)行四參數擬合（4-PL），如Origin、ELISACalc等，根據樣品的OD值由標準曲線(xiàn)推算出相應的擬合濃度，再乘以稀釋倍數即為樣本的測定濃度。