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PCR反應操作循環(huán)步驟

準備好各種試劑和PCR儀，就可以開(kāi)始PCR實(shí)驗：將各種試劑混合并按照說(shuō)明書(shū)設置PCR反應。一般PCR循環(huán)如下：
1. 起始步驟：這對于熱啟動(dòng)PCR而言是必須的，將反應混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時(shí)間取決于所選用的DNA聚合酶。
2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結構，而DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相結合。在這一步，反應混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA。這是PCR循環(huán)中的第1步。
3. 退火步驟：變性之后，DNA模板以單鏈的形式在反應混合液中存在。因為反應體系中的引物與DNA模板互補，當反應溫度降至50-65度時(shí)，引物與互補的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度。這一步通常維持20-40秒，而聚合酶會(huì )結合至引物-模板雙鏈處開(kāi)始DNA合成。
4. 延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開(kāi)始DNA合成，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的zui優(yōu)溫度。通常我們選用72度，但某些DNA聚合酶的zui適溫度是68度。這一步與體內的DNA復制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補規律將dNTPs加到引物的3’末端zui終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時(shí)間取決于目的DNA片段的長(cháng)度和DNA聚合酶的合成能力。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長(cháng)度的DNA。
5. 第2步至第4步稱(chēng)為一個(gè)循環(huán)：每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)。在前幾輪的PCR循環(huán)過(guò)程中PCR產(chǎn)物的量以指數速率增長(cháng)，但是到了反應后期隨著(zhù)dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應速率逐漸下降，因此PCR反應的產(chǎn)量也受到了限制。
6. zui后的延伸步驟：當30-35個(gè)循環(huán)結束后，我們通常會(huì )以68-74度延伸5-10分鐘，這是希望使反應體系中殘留的單鏈DNA全部反應完畢。
7. 維持時(shí)間：通常我們設置4-10度為反應后PCR產(chǎn)物的保存溫度。

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