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PCR擴增產(chǎn)物分析方法陳述

PCR擴增DNA片段只是一個(gè)重要手段。擴增片段的檢測和分析才是目的,根據研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴增產(chǎn)物的大小,有助于擴增產(chǎn)物的鑒定,點(diǎn)雜交除可鑒定擴增產(chǎn)物外,還有助于產(chǎn)物的分型;Southern雜交分析可從非特異擴增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小,增加檢測的特異性與敏感性,近期發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法(PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等)均有助于產(chǎn)物的精 確分析。

一、凝膠電泳分析法

PCR產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測,以前者常用,通過(guò)電泳可以判斷擴增產(chǎn)物的大小。在臨床檢測中,僅通過(guò)凝膠電泳判斷擴增片段大小即可滿(mǎn)足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內溶解,稍冷后倒入電泳槽。

電泳后,用溴化乙淀染色20min,然后用去離子水漂洗2次,每次15min,于UV燈下觀(guān)察結果并拍照。

凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小,檢測擴增的情況,還可以用來(lái)純化擴增產(chǎn)物。

二、點(diǎn)雜交

當擴增產(chǎn)物是多條帶時(shí),用點(diǎn)雜交更合適。這種方法的基本過(guò)程是,首先將擴增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上,再用放射性或非放射性標記物標記的探針雜交。點(diǎn)雜交還有助于檢測突變DNA的突變類(lèi)型,用于人類(lèi)遺傳病診斷和某些基因的分型。放射性同位素32P標記的寡核苷酸探針檢測的敏感性、特異性和方法的可靠性均不容懷疑,對人們認識某些疾 病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用。但是,由于同位素不穩定和放射性危害,不能常規用于臨床或法醫檢驗,用非放射性物質(zhì)(生物素、熒光素和地高辛等)標記的寡核苷酸探針?lè )治鯬CR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡(jiǎn)便而安 全的方法。非放射性標記物質(zhì)穩定性高,使用方便、安 全、檢測速度快。

、微孔板夾心雜交法

該法是通過(guò)一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上。然后,再用一生物素等非放射性標記物標記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區域雜交,漂洗后顯色即可判斷結果,該法需要兩個(gè)雜交過(guò)程來(lái)檢測一個(gè)產(chǎn)物,因此,其特異性較一次雜交的檢測法高。該法已用于HBV的檢測,其敏感度可達5個(gè)HBv DNA分子。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡(jiǎn)便、快速、避免了同位素標記探針的危害,顯色反應類(lèi)似于臨床常規應用的ELISA,適于臨床實(shí)驗室常規應用。

四、PCR-ELISA法

本法避免了電泳和雜交的步驟,適于常規ELISA記數儀檢測。因為5'端修飾后仍可進(jìn)行常規PCR擴增特異靶序列。因此,可以通過(guò)修飾一個(gè)引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因,而通過(guò)另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測。

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