ELISA是以免 疫學(xué)反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來(lái)的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法操作步驟:
1. 包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過(guò)夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽(yáng)性對照孔)。
3. 加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。
4. 加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀(guān)察結果：反應孔內顏色越深，陽(yáng)性程度越強，陰性反應為無(wú)色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+"、“-"號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零后測各孔O·D值，若大于規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽(yáng)性。