PCR引物長(cháng)度把控：
一般引物長(cháng)度為18~30堿基?？偟恼f(shuō)來(lái)，決定引物退火溫度重要的因素就是引物的長(cháng)度。引物的退火溫度一般選擇引物的（Tm值-5℃），有的直接用Tm值。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。
在引物長(cháng)度小于20bp時(shí)：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃
在引物長(cháng)度大于20bp時(shí)：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃
另外有許多軟件也可以對退火溫度進(jìn)行計算，其計算原理會(huì )各有不同，因此有時(shí)計算出的數值可能會(huì )有少量差距。為了優(yōu)化PCR反應，使用確保退火溫度不低于54℃的短的引物可獲得好的效率和特異性。
總的說(shuō)來(lái)，每增加一個(gè)核苷酸，引物特異性提高4倍，這樣，大多數應用的短引物長(cháng)度為18個(gè)核苷酸。引物長(cháng)度的上限并不很重要，主要與反應效率有關(guān)。由于熵的原因，引物越長(cháng)，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。
在利用軟件設計引物的時(shí)候，可以通過(guò)TM值反過(guò)來(lái)決定引物的長(cháng)度，特別是熒光定量PCR的引物，要控制TM=60℃左右。