細心地進(jìn)行引物設計是PCR中 zui 重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會(huì )同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個(gè)可以增加特異性的引物所具有的令人滿(mǎn)意的特點(diǎn)：
1、典型的引物18到24個(gè)核苷長(cháng)。引物需要足夠長(cháng)，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點(diǎn)的可能性。但是長(cháng)度大于24核苷的引物并不意味著(zhù)更高的特異性。較長(cháng)的序列可能會(huì )與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
2、選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像模板GC含量的引物。
3、設計5'端和中間區為G或C的引物。這會(huì )增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。
4、避免引物對3'末端存在互補序列，這會(huì )形成引物二聚體，抑制擴增。
5、避免3'末端富含GC。設計引物時(shí)保證在 zui 后5個(gè)核苷中含有3個(gè)A或T。
6、避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
7、避免存在可能會(huì )產(chǎn)生內部二級結構的序列，這會(huì )破壞引物退火穩定性。
目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點(diǎn)和啟動(dòng)子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時(shí)并不包括這些序列，但是應該對其進(jìn)行互補性和內部二級結構的檢測。
有時(shí)候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因為3'端 zui 后3個(gè)堿基的退火足以在錯誤位點(diǎn)起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。