一、準備和安裝過(guò)濾器
清洗好過(guò)濾器，干燥，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進(jìn)行高壓滅jun處理。 在超凈臺內打開(kāi)過(guò)濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待chu菌的液體中，出口端膠管深入到已消du好的瓶子中。用泵過(guò)濾，過(guò)濾后要檢查濾膜是否完好無(wú)損。
二、小牛血清的處理
人肺鱗癌細胞，SK-MES-1細胞市場(chǎng)上出售的小牛血清一般做了滅jun處理，但在使用前還應做熱滅活處理，即通過(guò)加熱的方法破壞補體(近來(lái)也有觀(guān)點(diǎn)認為熱滅活處理是不必要的)。胎牛血清不必滅活。
1、 將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。
2、 處理后的血清貯存于4℃。
3、 小牛血清在使用前進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。
三、生長(cháng)培養基的配制
除無(wú)血清培養之外，各種合成培養基在使用前需加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗jun 素。培養基分裝成小瓶(100～200 mL)以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。按如下比例配制： 基本培養基占80％~90％，小牛血清或胎牛血清占10％~20％。 按1％體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U／mL和100 μ／mL，。
四、凍存細胞的復蘇
應遵守慢凍快融的原則。先將水浴鍋調至37-37。5度，取出凍存的細胞迅速放入后將細胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。
在無(wú)菌臺內將完全培養基加入50ml的小培養瓶?jì)?，約5ml左右，然后用無(wú)菌吸管從凍存管內取出細胞，置培養并內輕輕搖晃，使細胞均勻后置培養箱內培養。
五、傳代
貼壁細胞:
對于貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基，吸的越干凈越好，以免中和后加入的消化液，使強度減弱（或PBS洗1－3次）。50ml培養瓶加入消化液約1-3ml，按此比例進(jìn)行消化，(根據經(jīng)驗)，晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37度培養箱約2-5分鐘，鏡下見(jiàn)細胞收縮變圓或少數脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細胞全部脫落，加入2-3ml完全培養基后，輕輕吹打，使細胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú)菌培養瓶?jì)?，加入完全培養基后繼續培養或實(shí)驗。
懸浮細胞:
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶?jì)?，加入完全培養基繼續培養，如要高濃度可先離心1000rpm，5min后加入完全培養基，輕輕吹勻后，分置其它培養瓶?jì)燃尤胪耆囵B基繼續培養。
六、凍存
將貼壁細胞消化后離心收集，懸浮細胞直接離心收集，以完全培養基或胎牛血清重懸細胞至終濃度約106/ml。加入10%的DMSO。以每管1～2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70攝氏度冰箱冷凍過(guò)夜。次日保存到液氮中。