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ELISA定性測定計算方法

這類(lèi)反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性,顯色清晰者為陽(yáng)性。但在 ELSIA中,正常人血清反應后??沙霈F呈色的本底,此本底的深淺因試劑的組成和實(shí)驗的條件不同而異,因此實(shí)驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類(lèi)似物。在用肉眼判斷結果時(shí),更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽(yáng)性的指標。目視法簡(jiǎn)捷明了,但頗具主觀(guān)性。在條件許可下,應該用比色計測定吸光值,這樣可以得到客觀(guān)的數據。先讀出標本(sample,S)、陽(yáng)性對照(P)、和陰性對照(N)的吸光值,然后進(jìn)行計算。計算方法有多種,大致可分為陽(yáng)性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類(lèi)。




1. 陽(yáng)性判定值


 陽(yáng)性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個(gè)特定的常數,以此作為判斷結果陽(yáng)性或陰性的標準。


 用此法判斷結果要求實(shí)驗條件十分恒定,試劑的制備必須標準化,陽(yáng)性和陰性的對照品應符合一定的規格,須配用精密的儀器,并嚴格按規定操作。陽(yáng)性判定值公式中的常數是在這特定的系統中通過(guò)對大量標本的實(shí)驗檢測而得到的?,F舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿,陽(yáng)性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng /ml。每次試驗設2個(gè)陽(yáng)性對照和3個(gè)陰性對照。測得A值后,先計算陰性對照A值的平均數(NC X )和陽(yáng)性對照A值的平均數(PCX),兩個(gè)平均數的差(P-N)必須大于一個(gè)特定的數值(例0.400),試驗才有效。3個(gè)陰性對照A值均應≥0.5×NCX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范圍,則棄去,而已另兩個(gè)陰性對照重新計算NCX;如有兩個(gè)陰性對照A值超出以上范圍,則該次實(shí)驗無(wú)效。陽(yáng)性判定值按下式計算:


陽(yáng)性判定值=NCX+0.05


標本 A值>陽(yáng)性判定值的為陽(yáng)性,小于陽(yáng)性判定值的為陰性。應注意的是,式中0.05為該試劑盒的常數,只適合于該特定條件下,而不是對各種試劑均可通用。


根據以上敘述可以看出,在這種方法中陰性對照和陽(yáng)性對照也起到試驗的質(zhì)控作用,試劑變質(zhì)和操作不當均會(huì )產(chǎn)生"試驗無(wú)效"的后果。




2. 標本/陰性對照比值


 在實(shí)驗條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下,這種判斷法較為合適。在得出標本( S)和陰性對照(N)的A值后,計算S/N值。也有寫(xiě)作P/N的,這里的P不代表陽(yáng)性(positive),而是病人(patient)的縮寫(xiě),不應誤解。為避免混淆,更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中,有些作者定出S/N為陽(yáng)性標準,現多為各種測定所沿用。實(shí)際上每一測定系統應該用實(shí)驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是,N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,以致反應后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此,這類(lèi)試劑盒規,如N<0.05(或其他數值),則按0.05計算,否則將出現假陽(yáng)性結果。

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