PCR反應條件詳解：
1. 變性：
在第1輪循環(huán)前,在94℃下變性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR 失敗,因為未變性完全的DNA 雙鏈會(huì )很快復性,減少DNA 產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94℃ 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時(shí)間主要是為使反應體系完全達到適當的溫度。對于富含GC 的序列,可適當提高變性溫度.但變性溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(cháng)都會(huì )導致酶活性的損失。
2. 退火：
這是PCR 的一個(gè)關(guān)鍵參數。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm 低5℃, 當產(chǎn)物中包含有影響實(shí)驗的非可異性擴增帶時(shí),以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì )減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。如果兩個(gè)引物Tm 不同，將退火溫度設定為比zui低的Tm 低5℃?；蛘邽榱颂岣咛禺愋?，可以在根據較高Tm 設計的退火溫度先進(jìn)行5 個(gè)循環(huán)，然后在根據較低Tm 設計的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。退火溫度越高,所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60℃和94℃)完成整個(gè)擴增循環(huán), 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數秒鐘即可完成,反應中所需時(shí)間主要是為使整個(gè)反應體系達到合適的溫度。
3. 延伸：
延伸反應通常為72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的zui適反應溫度75℃.實(shí)際上,引物延伸在退火時(shí)即已開(kāi)始,因為Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃.延伸反應時(shí)間的長(cháng)短取決于目的序列的長(cháng)度和濃度.在一般反應體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成1kb 長(cháng)的DNA。延伸時(shí)間過(guò)長(cháng)會(huì )導致產(chǎn)物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當增加延伸反應的時(shí)間。一般在擴增反應完成后,都需要一步較長(cháng)時(shí)間(10-30min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對以后進(jìn)行克隆或測序反應尤為重要。
4. 循環(huán)次數：
當其它參數確定之后, 循環(huán)次數主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數過(guò)多,會(huì )使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30 輪循環(huán)擴增后, 反應中Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴增,可將擴增的DNA 樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應底物進(jìn)行擴增, 這樣經(jīng)60 輪循環(huán)后, 擴增水平可達109-1010。擴增產(chǎn)物的量還與擴增效率有關(guān),擴增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:C＝Co(1+P)n 。其中：C 為擴增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA 量, P 為增效率, n 為循環(huán)次數。在擴增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數擴增的反應變成平坦的曲線(xiàn),產(chǎn)物不再隨循環(huán)數而明顯上升,這稱(chēng)為平臺效應。平臺期會(huì )使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環(huán)次數，在平臺期前結束反應，減少非特異性產(chǎn)物。