免yi熒光實(shí)驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱(chēng)為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。
基本實(shí)驗步驟：
（1） 細胞準備。對單層生長(cháng)細胞，在傳代培養時(shí)，將細胞接種到預先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長(cháng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長(cháng)細胞，取對數生長(cháng)細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。PBS洗滌3×5 min.
（3） 通透。使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.
（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
（6） 二抗結合。間接免yi熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。